類風(fēng)濕因子檢測(cè)

類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis ，RA）等疾病患者血清中出現(xiàn)的一種自身抗體。RF與變性IgG的Fc片段結(jié)合，形成免疫復(fù)合物沉積于關(guān)節(jié)腔，激活補(bǔ)體，造成免疫病理損傷。

原理

在微孔板上包被純化的兔IgG，加入經(jīng)稀釋的待測(cè)血清后，若血清中存在RF，就與兔IgG形成復(fù)合物，該復(fù)合物和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM抗體結(jié)合，洗滌后加入鄰苯二胺顯色，終止反應(yīng)后測(cè)定各反應(yīng)孔A492值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可查出與標(biāo)本的吸光度值對(duì)應(yīng)的血清IgM型RF濃度。

材料

抗原：兔IgG

微孔板

封口膜

包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液（50nmol/L，PH9.6）

包被液：兔IgG溶于包被緩沖液中，使終濃度為100mg/L

洗滌液/稀釋液：含0.05%Tween20的磷酸緩沖液（PBST）

封閉液：含10%牛血清白蛋白（100g/L）的碳酸鹽緩沖液

酶標(biāo)二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM

底物：鄰苯二胺（OPD）

終止液：2mol/L H2SO4

預(yù)處理待測(cè)血清：待測(cè)血清置56℃水浴箱孵育30min滅活補(bǔ)體

水浴箱

酶標(biāo)儀

操作步驟

1、微孔板的測(cè)試孔中加入50μl包被液，對(duì)照孔中僅加入50μl包被緩沖液，封口膜封板，37℃過夜。

2、PBST洗滌至少3次，每次3min，最后一次洗完后要倒置拍干孔中殘留洗滌液。

3、每孔加入50μl封閉液，37℃孵育1h。

4、同步驟2洗滌。

5、滅活的血清先1:10稀釋，再連續(xù)1:4稀釋5次，使血清稀釋度從1:10至1:10 240。

6、每孔加入各稀釋度血清50μl，4℃孵育3h。

7、同步驟2洗滌。

8、每孔加入50μl 1:1000稀釋的酶標(biāo)二抗，4℃孵育2h。

9、同步驟2洗滌。

10、配制底物液：20mg OPD溶于20ml pH5.0的檸檬酸緩沖液中，再加入8μl30%濃度的H2O2，混勻。

11、每孔加入50μl底物液，37℃避光孵育30min。

12、每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定A492值。

結(jié)果分析

每反應(yīng)板同時(shí)用參考血清按上法做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由各標(biāo)本的A值可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的血清RF濃度。

注意事項(xiàng)

1、兔IgG作為抗原和人IgG Fc段作為抗原在檢測(cè)中無明顯差異。

2、加入終止液后應(yīng)輕拍微孔板以保證混合均勻。

3、每次實(shí)驗(yàn)需做陽性和陰性對(duì)照。