實驗原理

以抗細(xì)胞因子單抗包被酶聯(lián)板，與標(biāo)本中相應(yīng)的細(xì)胞因子特異性反應(yīng)，然后加入生物素抗生物素放大的酶標(biāo)抗細(xì)胞因子抗體，再經(jīng)酶底物顯色，顏色深淺表示細(xì)胞因子量的多少。

elisa試劑盒與器材

抗細(xì)胞因子單抗

生物素1抗細(xì)胞因子抗體

抗生物素-酶

細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品

底物（OPD或TMB）

終止液（2N硫酸）

96微孔板

稀釋液和洗滌液

包被緩沖液（0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液）

酶標(biāo)儀

操作步驟

1、用包被緩沖液稀釋抗細(xì)胞因子單抗，濃度為10μg/ml，包被96孔板，每孔加100μl，4℃包被過夜，次日用洗液洗包被板3次。

2、每孔加1%BSA-PBS封閉液200μl，室溫封閉2h，用洗液洗3次。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液倍比稀釋，范圍為1000；500；250；125；62.5；31.25；15.6（pg/ml），每孔加100μl，每一稀釋度須做雙復(fù)孔。標(biāo)準(zhǔn)品通常儲存在-30℃或冷凍干燥后4℃保存，溶解后須一次用完。

4、檢測標(biāo)本可作適當(dāng)稀釋，每孔加入100μl，每一樣本建議做雙復(fù)孔。同時設(shè)正常對照和空白對照。

5、37℃孵育1h或室溫孵育2h，然后洗板3-5次。

6、每孔加生物素-抗細(xì)胞因子抗體100μl，37℃孵育1h或室溫孵育2h，然后洗板3-5次。

7、每孔加抗生物素-酶100μl，37℃孵育30min，然后洗板3-5次。

8、每孔加底物100μl，37℃避光孵育20min。

9、每孔加終止液50μl，酶標(biāo)儀讀取A492值（OPD）或A450（TMB）。

注意事項

一、標(biāo)本的采取和保存

1、血清標(biāo)本應(yīng)避免嚴(yán)重溶血，否則可能會增加非特異性顯色。

2、血清應(yīng)避免細(xì)菌污染，否則會因菌體中的內(nèi)源性HRP而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

3、許晴如渾濁或沉淀應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

4、標(biāo)本宜在新鮮時檢測。若5d內(nèi)檢測，可使用冰箱2-8℃保存，超過一周時間測定，應(yīng)于-20℃低溫凍存。樣本的長時間保存應(yīng)在-70℃以下。

二、elisa試劑盒準(zhǔn)備

從冰箱中取出elisa試劑盒，等待溫度與室溫平衡后在使用。否則可能會造成后面溫育時間不夠，其直接的后果是一些弱陽性標(biāo)本出現(xiàn)假陽性。

三、加樣及反應(yīng)試劑：

加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。

四、孵育

孵育是elisa測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素。常用的孵育溫度和時間有37℃ 1-2h和4℃過夜。較高的孵育溫度下，反應(yīng)時間可縮短，但對分子含量少的弱陽性標(biāo)本有漏檢的可能。因此，建議elisa檢測時盡量使用較低溫度孵育較長時間。如果需要使用較高孵育溫度，盡量采用水浴，孵育時讓酶標(biāo)板浮于水面上，或?qū)⒔杆募啿贾糜陲埡兄惺钩梢粷窈?，放于溫箱中?/p>

五、洗板

每次孵育后洗板是否徹底，與特異背景顯色有很大的關(guān)系，所以洗板一定要認(rèn)真仔細(xì)。

六、顯色

加入底物A液和B液前應(yīng)分別混勻，棄去第一滴，加入后應(yīng)振蕩混勻。

1、顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑。

2、加顯色劑時應(yīng)避免其外流。

3、A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。

4、在加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或Eppendorf管中，觀察是否有顯色反應(yīng)，如有，則說明底物已變質(zhì)。

七、讀板

1、讀板時應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。

2、讀板時，一定要注意酶標(biāo)儀是否已調(diào)至合適波長。

3、如有條件，建議盡量采用雙波長比色，這樣可排除有酶標(biāo)板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響。