實(shí)驗(yàn)原理
以抗細(xì)胞因子單抗包被酶聯(lián)板，與標(biāo)本中相應(yīng)的細(xì)胞因子特異性反應(yīng)，然后加入生物素抗生物素放大的酶標(biāo)抗細(xì)胞因子抗體，再經(jīng)酶底物顯色，顏色深淺表示細(xì)胞因子量的多少。
elisa試劑盒與器材
抗細(xì)胞因子單抗
生物素1抗細(xì)胞因子抗體
抗生物素-酶
細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品
底物（OPD或TMB）
終止液（2N硫酸）
96微孔板
稀釋液和洗滌液
包被緩沖液（0.05mol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液）
酶標(biāo)儀
操作步驟
1、用包被緩沖液稀釋抗細(xì)胞因子單抗，濃度為10μg/ml，包被96孔板，每孔加100μl，4℃包被過(guò)夜，次日用洗液洗包被板3次。
2、每孔加1%BSA-PBS封閉液200μl，室溫封閉2h，用洗液洗3次。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋液倍比稀釋?zhuān)秶鸀?000；500；250；125；62.5；31.25；15.6（pg/ml），每孔加100μl，每一稀釋度須做雙復(fù)孔。標(biāo)準(zhǔn)品通常儲(chǔ)存在-30℃或冷凍干燥后4℃保存，溶解后須一次用完。
4、檢測(cè)標(biāo)本可作適當(dāng)稀釋?zhuān)靠准尤?00μl，每一樣本建議做雙復(fù)孔。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照和空白對(duì)照。
5、37℃孵育1h或室溫孵育2h，然后洗板3-5次。
6、每孔加生物素-抗細(xì)胞因子抗體100μl，37℃孵育1h或室溫孵育2h，然后洗板3-5次。
7、每孔加抗生物素-酶100μl，37℃孵育30min，然后洗板3-5次。
8、每孔加底物100μl，37℃避光孵育20min。
9、每孔加終止液50μl，酶標(biāo)儀讀取A492值（OPD）或A450（TMB）。
注意事項(xiàng)
一、標(biāo)本的采取和保存
1、血清標(biāo)本應(yīng)避免嚴(yán)重溶血，否則可能會(huì)增加非特異性顯色。
2、血清應(yīng)避免細(xì)菌污染，否則會(huì)因菌體中的內(nèi)源性HRP而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。
3、許晴如渾濁或沉淀應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。
4、標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。若5d內(nèi)檢測(cè)，可使用冰箱2-8℃保存，超過(guò)一周時(shí)間測(cè)定，應(yīng)于-20℃低溫凍存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存應(yīng)在-70℃以下。
二、elisa試劑盒準(zhǔn)備
從冰箱中取出elisa試劑盒，等待溫度與室溫平衡后在使用。否則可能會(huì)造成后面溫育時(shí)間不夠，其直接的后果是一些弱陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)假陽(yáng)性。
三、加樣及反應(yīng)試劑：
加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。
四、孵育
孵育是elisa測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。常用的孵育溫度和時(shí)間有37℃ 1-2h和4℃過(guò)夜。較高的孵育溫度下，反應(yīng)時(shí)間可縮短，但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性標(biāo)本有漏檢的可能。因此，建議elisa檢測(cè)時(shí)盡量使用較低溫度孵育較長(zhǎng)時(shí)間。如果需要使用較高孵育溫度，盡量采用水浴，孵育時(shí)讓酶標(biāo)板浮于水面上，或?qū)⒔杆募啿贾糜陲埡兄惺钩梢粷窈?，放于溫箱中?/p>
五、洗板
每次孵育后洗板是否徹底，與特異背景顯色有很大的關(guān)系，所以洗板一定要認(rèn)真仔細(xì)。
六、顯色
加入底物A液和B液前應(yīng)分別混勻，棄去第一滴，加入后應(yīng)振蕩混勻。
1、顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑。
2、加顯色劑時(shí)應(yīng)避免其外流。
3、A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
4、在加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或Eppendorf管中，觀察是否有顯色反應(yīng)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。
七、讀板
1、讀板時(shí)應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。
2、讀板時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀是否已調(diào)至合適波長(zhǎng)。
3、如有條件，建議盡量采用雙波長(zhǎng)比色，這樣可排除有酶標(biāo)板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響。