PCR技術(shù)原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）：又稱聚合酶鏈式反應(yīng)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在模板DNA、因為和脫氧核糖核酸存在下，在耐熱DNA聚合酶作用下，經(jīng)過DNA鏈熱變性、引物退火和引物延伸三個步驟，循環(huán)往復(fù)，使DNA片段在短時間內(nèi)迅速擴增。它具有特異、敏感、高產(chǎn)率、快速、簡便、重復(fù)性好、自動化等突出特點，在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用。

PCR條件對應(yīng)的影響

變性溫度與時間

模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，從而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30 s，高溫變性溫度不宜超過95℃。

退火溫度與時間

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進行推測，一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為30-60 s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

引物

引物與模板錯配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸，最高不宜超過30個核苷酸，最佳長度為20-24個核苷酸，如需插入酶切位點，應(yīng)在酶切位點5’端加保護堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量應(yīng)盡量相近。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在引物3’端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)色譜層析或PAGE純化以除去未能合成至全長的短鏈雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增，濃度太低則擴增產(chǎn)物太少。

酶量

50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變機率，尤其在進行高保真擴增時，盡量減少酶量，但酶量過少時反應(yīng)性能會下降。

延伸溫度與時間

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇70-75℃之間，延伸時間根據(jù)所選聚合酶擴增速度和擴增片段大小設(shè)定，如同樣擴增2kb片段，使用Taq酶只需1min，使用高保真酶則需2min以上。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增，時間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板的量，擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

模板

模板可以是單鏈DNA也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過1μg為宜，因為模板量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加，但同時要考慮模板中靶序列的含量。