[目的]：
研究 Ca2＋-calpain/p35 -CDK5/p25 途徑在 BDE-153 神經(jīng)毒性中的作用，為探尋BDE-153 神經(jīng)發(fā)育毒性的機(jī)制提供研究線索。
[方法]：
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法：將出生 10 天的雄性仔鼠按窩別和體重隨機(jī)分成 4 組，分別設(shè)為橄欖油溶劑對(duì)照、1mg/kg，5 mg/kg 和 10 mg/kg BDE-153 組，每組 10 只。按 10 ml/kg 一次性腹腔注射染毒。在染毒后 1 月齡和 2 月齡時(shí)，用 Morris 水迷宮，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的神經(jīng)行為功能，用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的自發(fā)活動(dòng)能力。染毒 2 月后，用 HE 染色檢測(cè)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并在電鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。用 TUNEL 染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和 Ca2+濃度，用乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LDH 漏出率。Real time QPCR 和 Western Bolt 技術(shù)檢測(cè) calpain、CDK5 以及 p25 和 p35基因和蛋白表達(dá)的改變，ELISA 試劑盒檢測(cè) calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶的活力。體外實(shí)驗(yàn)方法：原代培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠神經(jīng)元，經(jīng)神經(jīng)元純度鑒定后，隨機(jī)分為空白組，DMSO（溶劑）組， 10μmol/L BDE-153, 20μmol/L BDE-153， 40μmol/LBDE-153，染毒 48h后，顯微鏡下觀察原代神經(jīng)細(xì)染毒后的形態(tài)學(xué)改變，CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的活力，用 LDH 檢測(cè)試劑盒檢測(cè) LDH 漏出率。Hochest33258 染色，AO/EB 雙熒光染色以及流式細(xì)胞儀等方法觀察和檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況、細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度；Realtime QPCR 技術(shù)、免疫熒光技術(shù)檢測(cè) calpain、CDK5 以及 p35 基因和蛋白表達(dá)的改變，并用 ELISA試劑盒檢測(cè) calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶活力。另外，采用 PD150606抑制 calpain 后，CCK-8 法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞活力，ELISA試劑盒檢測(cè) calpain，CDK5/p25 和CDK5/p35 激酶活力的改變。
[主要試劑和儀器]
CCK-8 （Cell Counting Kit-8）,dojindo 株式會(huì)社ELISA檢測(cè)試劑盒，上海江萊生物酶標(biāo)分析儀，BIO-RAD680 型，美國(guó) Bio Rad 公司caplain 抑制劑PD150606：5mg 的 PD150606 離心后用 2.72ml DMSO 充分溶解，則配成濃 度 為 6mmol/L 的 貯 備 液 ， 取 0.73μl 稀 釋 成 5mmol/L, 逐 步 配 制 成4mmol/L,2.5mmol/L,2mmol/L,1mmol/L,0.5mmol/L 的使用液。
江萊生物產(chǎn)品文獻(xiàn)：Ca_2_calpain_p35_省略_DE_153神經(jīng)毒性中的作用研究