間接法的原理

標(biāo)本中的待檢抗體與固相抗原結(jié)合后，利用酶標(biāo)與抗體（抗人Ig）進(jìn)行檢測(cè)。

測(cè)定抗體的簡(jiǎn)接ELISA法。病原體或其他外源大分子物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后都可能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以可以通過檢測(cè)某種病原體的相應(yīng)抗體來判斷機(jī)體是否曾經(jīng)被某種病原體所感染，達(dá)到診斷的目的。

間接法是測(cè)定抗體最常用的方法。該方法首先將已知定量的抗原（如某個(gè)病原體的蛋白質(zhì)）吸附（也稱包被）與固相載體（微孔滴定板的微孔內(nèi)），加入待檢測(cè)的樣品（如病人血清含相應(yīng)抗體為第一抗體）與之結(jié)合。溫育反應(yīng)一定時(shí)間。此時(shí)，如果血清中含有該病原體蛋白質(zhì)的抗體（第一抗體）時(shí)，則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（第二抗體即酶標(biāo)抗抗體，如血清為人血清，則加入抗人抗體的抗體），該酶標(biāo)抗抗體就與已知固相抗原結(jié)合的第一抗體結(jié)合，形成抗原—抗體—酶標(biāo)第二抗體的復(fù)合物，同樣保溫、洗滌后加入無色的酶底物，保溫一定時(shí)間進(jìn)行酶促反應(yīng)，酶催化底物顯色，觀察反應(yīng)后顏色的有無及深淺來判斷反應(yīng)結(jié)果。若有顏色反應(yīng)，說明檢測(cè)樣品中含有相應(yīng)的抗體，所以是陽性反應(yīng)。根據(jù)顏色深淺，還可以進(jìn)行定量分析。反之，若無色，說明樣品中無相應(yīng)抗體，為陰性反應(yīng)。

間接法的操作步驟

1、包被固相載體：用已知抗原包被固相載體，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原和雜質(zhì)；

2、封閉：用高濃度無關(guān)蛋白封閉，阻止待檢血清中非特異IgG吸附固相；

3、加待檢樣本：經(jīng)過溫育（37℃ 2h），使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合。洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)；

4、加酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)SPA：再次溫育（37℃ 2h），使酶標(biāo)抗抗體與 固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成固相抗原—待檢抗體—酶標(biāo)抗抗體（酶標(biāo)SPA）復(fù)合物；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體；

5、加底物顯色：溫育（37℃ 30min）；

6、終止反應(yīng)判定結(jié)果，目測(cè)定性或用酶標(biāo)儀測(cè)光密度進(jìn)行定量分析。

間接法的方法評(píng)價(jià)

酶聯(lián)免疫間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，應(yīng)用廣泛，敏感，應(yīng)用一種酶標(biāo)抗抗體可以用于檢測(cè)一個(gè)種系內(nèi)各種抗原的相應(yīng)抗體。

間接法的應(yīng)用

間接ELISA法主要用于抗體的檢測(cè)。運(yùn)用此法可以檢測(cè)：人類免疫缺陷病毒HIV（-1/2）抗體，丙型肝炎病毒抗體（抗HCV），戊肝抗體（抗HEV），庚肝抗體（抗HGV）等。以檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體為例，如下：

檢測(cè)丙型肝炎病毒的適應(yīng)癥為：用于檢測(cè)血清或血漿中丙型肝炎抗體，供獻(xiàn)血員篩選機(jī)臨床輔助診斷。其原理為：將HCV結(jié)構(gòu)區(qū)核心蛋白和非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的混合抗原包被于微孔條，樣品加到固相抗原板上，當(dāng)樣品中含有HCV特異性抗體（第一抗體時(shí)），則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗人（IgG），則該抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體（第二抗體），該酶標(biāo)抗體就與已和固相抗原結(jié)合的第一抗體結(jié)合，形成抗原—抗體—酶標(biāo)第二抗體的復(fù)合物，再加底物，酶催化底物顯色。在因性反應(yīng)中，因樣品中不含HCV的抗體，酶標(biāo)抗體不能與之結(jié)合，故無顏色變化。