原理

Elisa試劑盒是將完成一個(gè)項(xiàng)目所需要的各種試劑、材料組合在一起，方便實(shí)驗(yàn)人員使用的一種工具。由于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用到的試劑種類(lèi)繁多，配置要求較高，但用量較少，因此通過(guò)試劑盒，可以減輕實(shí)驗(yàn)人員的工作量，而且保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。

目前用于質(zhì)粒抽提的Elisa試劑盒很多，絕大部分Elisa試劑盒均在堿裂解法的基礎(chǔ)上，利用硅膠柱吸附質(zhì)粒DNA，去除雜質(zhì)，之后用洗脫緩沖液將吸附的質(zhì)粒DNA洗脫下來(lái)。此法所得的質(zhì)粒DNA絕大部分為超螺旋DNA，純度較高；同時(shí)，此法不需要使用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，操作更為簡(jiǎn)便。

實(shí)驗(yàn)試劑

1、LB液體培養(yǎng)基：10g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨（tryptone），5g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物（yeast extract），10gNaCl，溶于800ml水中，加熱溶解后，用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0,121℃高壓滅菌20min，備用。

2、50mg/ml氨芐青霉素溶液：1g氨芐青霉素溶于200ml水中，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝至小管中，-20℃貯存。

3、質(zhì)粒小量抽提Elisa試劑盒

4、無(wú)水乙醇

5、瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑

實(shí)驗(yàn)步驟

1、將RNase A溶液全部加入溶液I中，均勻混合后4℃保存。

2、在Wash Solution中加入4倍體積的無(wú)水乙醇。

3、從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5ml含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取1.5ml的過(guò)夜培養(yǎng)菌液，12000r/min離心2min，棄上清液。

4、用250μL Solution I（含RNase A），充分懸浮細(xì)菌沉淀，靜置2min。

5、加入250μL Solution II，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)五六次，至溶液呈澄清透明狀。

6、加入350μL Solution III，溫和混勻，靜置5min后，12000r/min離心10min。

7、將Elisa試劑盒中的EZ-10 Column置于Colleetion Tube上，將6的上清液轉(zhuǎn)移至EZ-10 Column中，8000r/min離心2min，棄去濾液。

8、在EZ-10 Column中加入500μL Wash Solution，10000r/min離心1min。

9、重復(fù)步驟8.

10、棄去濾液，10000r/min再離心2min，以充分去除Wash Solution。

11、將EZ-10 Column轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的1.5mL離心管中，在EZ-10 Column中加入50μL Elution Buffer，靜置5min，10000r/min離心2min，離心管中所得即為質(zhì)粒DNA。

12、取5μL樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1、嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行，不可隨意更改相關(guān)溶液體積及或離心時(shí)間、速度等。

2、在將溶液加入EZ-10 Column中時(shí)，槍頭不要觸碰硅膠膜。