作為研究基因表達(dá)調(diào)控的重要方法，近年來染色質(zhì)免疫共沉淀得到了越來越廣泛的應(yīng)用，但有關(guān)將乳腺組織作為ChIP材料的研究及其方法尚未見報(bào)道。

　　近期來自廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等處的研究人員提出了一種新型乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀方法，這種方法獲得的DNA樣品中， 靶序列得到顯著的富集， 所得的DNA樣品能夠滿足測序（ChIP Seq） 要求。結(jié)果說明， 改進(jìn)后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀， 并為研究乳腺組織基因表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

　　基因的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)蛋白的調(diào)控， 基因表達(dá)調(diào)控常用研究方法包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實(shí)驗(yàn)、 電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)、 酵母單雜交系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉 淀 技 術(shù)。盡管這4種方法均可以鑒定轉(zhuǎn)錄因子在DNA 中的結(jié)合位點(diǎn)， 但前3種方法需要將DNA與轉(zhuǎn)錄因子分離到體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 無法真實(shí)地反映在不同生理狀態(tài)下， 轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)靶基因識別與結(jié)合的真實(shí)情況。

　　ChIP技術(shù)通過甲醛交聯(lián)， 將某一時(shí)刻DNA與轉(zhuǎn)錄因子之間的作用情況“ 快照” 下來， 可真實(shí)、 完整地反映特定時(shí)刻下， 目的蛋白在全基因組序列中的結(jié)合情況， 因此，近年來該技術(shù)得到越來越廣泛的應(yīng)用。ChIP研究多以細(xì)胞系或從組織分離培養(yǎng)所得的細(xì)胞為材料， 但離體培養(yǎng)的細(xì)胞無法完全模擬體內(nèi)細(xì)胞相應(yīng)的生理狀態(tài)， 無法排除細(xì)胞培養(yǎng)過程中對基因表達(dá)及其調(diào)控產(chǎn)生的影響。已有直接將組織作為

　　ChIP材料、 避免細(xì)胞培養(yǎng)可能產(chǎn)生的潛在影響的報(bào)道。目前有關(guān)組織ChIP方法遠(yuǎn)不及以細(xì)胞 ChIP方法成熟， 相關(guān)研究報(bào)道也較少， 同時(shí)急需進(jìn)一步研究完善適合不同組織的ChIP方法。

　　ChIP技術(shù)通過甲醛交聯(lián)固定結(jié)合在染色質(zhì)上的蛋白， 經(jīng)細(xì)胞裂解、 染色質(zhì)斷裂， 用結(jié)合有相應(yīng)抗體的沉降珠捕獲并分離目的蛋白DNA復(fù)合物， 最后經(jīng)反交聯(lián)、 純化后， 得到與目的蛋白結(jié)合的 DNA片段。目前大多數(shù)利用 ChIP技術(shù)對DNA與蛋白之間相互作用進(jìn)

　　行的研究均是以細(xì)胞為材料， 將活體組織作為ChIP材料的報(bào)道較少， 尚未有以乳腺組織為 ChIP材料的報(bào)道。與脾臟等組織不同， 乳腺組織中含有大量乳腺纖維， 致使樣品均一化處理時(shí)難以分離得到呈單一狀分布的細(xì)胞， 且細(xì)胞容易破損， 回收率低。泌乳期乳腺細(xì)胞裂解后， 裂解液中含有大量的乳脂和乳蛋白， 嚴(yán)重影響雜交效率。超聲法斷裂染色質(zhì)過程中易產(chǎn)生積熱、 易導(dǎo)致反交聯(lián)和蛋白質(zhì)變性， 因此對超聲波儀的溫控要求較高。

　　針對以上問題， 研究人員以Stat5a為目的蛋白對傳統(tǒng)的組織染色質(zhì)免疫共沉淀方法進(jìn)行了改進(jìn)， 尋找適合乳腺組織的染色質(zhì)免疫共沉淀方法。

　　研究人員省略組織均一化步驟、 用酶切 超聲法代替超聲法進(jìn)行染色質(zhì)片段化、 在細(xì)胞裂解和酶切步驟間增加洗滌步驟。結(jié)果顯示， 與脾臟組織相比， 乳腺組織不適合進(jìn)行組織均一化處理。酶切 超聲法比超聲法更適于對乳腺組織進(jìn)行染色質(zhì)片段化。采用改進(jìn)后的 ChIP方法獲得的DNA樣品中， 靶序列得到顯著的富集， 所得的DNA樣品能夠滿足測序（ChIP Seq） 要求。結(jié)果說明， 改進(jìn)后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀。

　　研究人員認(rèn)為，利用改進(jìn)后的方法， 將乳腺組織經(jīng)抗體與磁珠耦合、 組織處理、 交聯(lián)、 酶切 超聲裂解、 孵育、洗滌、 反交聯(lián)和純化共8步處理后， 經(jīng)QPCR方法證實(shí)， 得到了富集有 Stat5a靶序列片段的DNA片段， 且樣品質(zhì)量達(dá)到華大公司對ChIP樣品的測序要求。測序分析結(jié)果顯示， 利用改進(jìn)后的ChiP方法獲得的樣品數(shù)據(jù)背景干凈、 峰形顯著、 重復(fù)性高， 可滿足ChIP Seq要求。

　　這些結(jié)果說明， 改進(jìn)后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀， 該方法為研究乳腺基因表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

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