近日，來自美國威斯康星大學的華人科學家Su-Chun Zhang在國際學術(shù)期刊Cell Stem Cell發(fā)表了一項最新研究進展，他們利用CRISPR/CAS9技術(shù)實現(xiàn)了對人類干細胞系進行可誘導基因敲除，這一方法的成功對于研究基因在干細胞及分化不同階段中的作用具有重要推動作用。

對基因表達進行精確的時間調(diào)控對于闡明一個基因在生物學系統(tǒng)中的功能至關(guān)重要，但到目前為止，在人類多能干細胞中實現(xiàn)可誘導基因敲除，建立可誘導基因敲除的人類干細胞系仍存在很大挑戰(zhàn)。

在該項研究中，研究人員結(jié)合CRISPR/CAS9介導的基因組編輯和Flp/FRT以及Cre/LoxP系統(tǒng)成功實現(xiàn)建立了可誘導基因敲除的人類多能干細胞系。研究人員發(fā)現(xiàn)dual-sgRNA的靶向作用對于將FRT序列進行精確的雙等位基因敲入非常重要。除此之外，他們還開發(fā)了出一種新的策略將一個可調(diào)控活性的重組酶表達體系同時導入細胞，移除了藥物抗性基因，利用這種方法可以加快iKO hPSC細胞系的獲得速度。

研究人員通過這種兩步法敲除策略，對人類胚胎干細胞和誘導多能干細胞中的SOX2,PAX6,OTX2,AGO2等基因?qū)崿F(xiàn)了可誘導性基因敲除，建立了相關(guān)細胞系。

研究人員相信，利用這種方法建立iKO hPSC細胞系將會改變?nèi)藗円酝鶎θ祟惣毎谢蚬δ苎芯康姆绞剑瑢τ谕苿痈杉毎芯窟M展具有重要意義。

原文內(nèi)容：

Engineering Human Stem Cell Lines with Inducible Gene Knockout using CRISPR/Cas9

Yuejun Chen6correspondenceemail, Jingyuan Cao6, Man Xiong6, Andrew J. Petersen, Yi Dong, Yunlong Tao, Cindy Tzu-Ling Huang, Zhongwei Du, Su-Chun Zhang

Precise temporal control of gene expression or deletion is critical for elucidating gene function in biological systems. However, the establishment of human pluripotent stem cell (hPSC) lines with inducible gene knockout (iKO) remains challenging. We explored building iKO hPSC lines by combining CRISPR/Cas9-mediated genome editing with the Flp/FRT and Cre/LoxP system. We found that "dual-sgRNA targeting" is essential for biallelic knockin of FRT sequences to flank the exon. We further developed a strategy to simultaneously insert an activity-controllable recombinase-expressing cassette and remove the drug-resistance gene, thus speeding up the generation of iKO hPSC lines. This two-step strategy was used to establish human embryonic stem cell (hESC) and induced pluripotent stem cell (iPSC) lines with iKO of SOX2, PAX6,OTX2, and AGO2, genes that exhibit diverse structural layout and temporal expression patterns. The availability of iKO hPSC lines will substantially transform the way we examine gene function in human cells.

原文地址：http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(15)00261-1