實(shí)驗(yàn)原理

   RNA可以使用非變性或變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。在非變性電泳中，雖然可以分離混合物中不同分子量的RNA分子，但是無法確定分子量，主要是RNA分子存在二、三級結(jié)構(gòu)二影響其電泳結(jié)果。只有在變性情況下，RNA分子完全伸展，其泳動(dòng)率才與分子量成正比。因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛或戊二醛。

實(shí)驗(yàn)步驟

   1.將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。

   2.制膠：稱取0.25g瓊脂糖，加入放有18.3ml的DEPC水的錐形瓶中，加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入2.5ml的10×電泳緩沖液、4.25ml的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠，插好梳子，水平放置待凝固后使用

   3.加樣：將凝固后的甲醛瓊脂糖凝膠從制膠槽轉(zhuǎn)移至電泳槽，加入電泳緩沖液待上樣。在一個(gè)潔凈的小離心管中混合以下試劑：電泳緩沖液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺10μl、RNA樣品3.5μl?；靹颍?0℃保溫10分鐘，冰上速冷。加入3μl、的上樣緩沖液混勻，取適量加樣于凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)。同時(shí)點(diǎn)RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。

   4.電泳：連接電源線，打開電泳儀，穩(wěn)壓5V/cm電泳。

   5.觀察電泳結(jié)果：當(dāng)指示劑電泳至膠中部即可結(jié)束電泳，通過紫外分析儀，對電泳膠進(jìn)行觀察和照相，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

   6.分析電泳結(jié)果：記錄所觀察的電泳圖譜，注意每條帶的相對位置及濃淡情況等。在正常情況下，紫外燈下可見28S、18S和5S rRNA三條帶，觀察28S和18S二條帶是否清晰，若28S的熒光強(qiáng)度為18S的二倍以上，則說明RNA分子沒有降解。

注意事項(xiàng)

   1.實(shí)驗(yàn)中必須防止RNase污染以免RNA降解。

   2.所有試劑用DEPC水配制，用具也用DEPC水沖洗，并蒸汽滅菌。