原理

抗原提呈細(xì)胞、抗原以及抗原特異性T雜交瘤細(xì)胞混合放在96孔板中共同孵育，一段時間以后，測定上清中抗原特異性T雜交瘤細(xì)胞分泌的IL-2水平即可反映抗原提呈的作用。如果是可溶性抗原可選用DC作為APC，而如果是顆粒性抗原或者脂類包被的抗原，則應(yīng)選用巨噬細(xì)胞作為APC，所選的APC應(yīng)與T雜交瘤細(xì)胞具有相同的MHC約束性。

主要試劑與器材

1、APC（此處選用腹腔滲出細(xì)胞）、T雜交瘤細(xì)胞、抗原。

2、DMEM培養(yǎng)液、96孔平底培養(yǎng)板。

3、IL-2ELISA試劑盒

4、離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱。

操作步驟

1、收集腹腔滲出細(xì)胞，以DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml，加入96孔平底培養(yǎng)板中，每孔100μl。

2、收集新鮮培養(yǎng)的T雜交瘤細(xì)胞，室溫1000rpm離心10min。以預(yù)溫至37℃的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml。加入上訴96孔培養(yǎng)板中，每孔50μl。

3、配置1mmol/L的抗原工作液，以DMEM液作系列稀釋，一般以對數(shù)（1:10）或半對數(shù)（1:3.16）稀釋為宜。

4、將系列稀釋的抗原溶液加入96孔板中，每孔50μl。每個濃度做3復(fù)孔，同時以不加抗原孔作為陰性對照。

5、將96孔板置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24h。

6、取出96孔板，1200rpm離心10min。

7、吸取上清，-80℃凍存待測，或直接用IL-2Elisa試劑盒或細(xì)胞生物學(xué)方法檢測上清液IL-2含量。

注意事項

1、配制抗原溶液及進(jìn)行系列稀釋時，培養(yǎng)板應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中。

2、以合成肽作為抗原時，肽應(yīng)溶解于去離子水中，1mmol/L的工作液4℃可保存數(shù)日，應(yīng)避免以含鹽緩沖液溶解肽，因?yàn)辂}可引起肽沉淀。如果以蛋白作為抗原時，則可將蛋白直接溶解于DMEM培養(yǎng)液中，立即使用。

3、APC、抗原及T雜交瘤細(xì)胞加入次序不限。