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【江萊生物-老牌Elisa試劑盒廠家】

【江萊生物-老牌Elisa試劑盒廠家】 2016-11-22 15:00:01

隨著對蛋白質研究的不斷深入,人們將免疫沉淀方法與其他方法相結合,在其基礎上衍生出很多更為復雜的技術,使蛋白質分析方法更為多樣化,應用范圍更為廣泛。該技術現已廣泛應用于基因、蛋白質以其相互作用等研究領域。按應用范圍分類,可分為以下四類:

 

1、免疫沉淀(Individual protein immunoprecipitation, IP):利用抗體特異性從細胞裂解物或其他可溶性生物樣品中純化已知特定蛋白質。IP與SDS-PAGE方法聯用時,可達到測量蛋白質相對分子量,對已知抗原定量,確定蛋白質降解速率等目的。

 

2、免疫共沉淀(Protein complex immunoprecipitation , Co-IP):利用抗體沉淀相應特定抗原,同時沉淀與該抗原相互結合的其他分子,主要用于研究蛋白質相互作用。Co-IP與WB或質譜方法結合,可用于確定特定蛋白-興趣蛋白在天然狀態(tài)下的結合情況,確定特定蛋白質的新作用搭檔。

 

3、染色質免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質-DNA復合物,并將其隨機切斷,通過免疫沉淀復合體特異性富集目的蛋白結合的DNA片段,再通過對DNA片段的純化和檢測,獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態(tài)作用,還可用于研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達間的關系。將ChIP與基因芯片相結合形成的ChIP-on-chip方法,可用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;ChIP與體內足跡法相結合,可用于尋找反式因子的體內結合位點。

 

4、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP):其原理與ChIP相近,但RNA免疫沉淀是用來研究與蛋白質結合的RNA在基因表達調控中的作用。
RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網絡動態(tài)過程的有力工具,能幫助我們發(fā)現miRNA的調節(jié)靶點。RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉淀ChIP技術的類似應用,但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物,RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同(如復合物不需要固定,RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經RIP實驗驗證等等)。RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip,幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化

免疫沉淀的關鍵影響因素

 

每種免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序,但都是以抗原-抗體特異性結合為基礎。目前常規(guī)操作是利用共價結合蛋白A或蛋白G的瓊脂糖或磁性微球將反應后的抗原-抗體復合物富集純化。蛋白A和蛋白G能特異地和抗體的保守區(qū)Fc段結合,形成穩(wěn)定的抗原-抗體復合物附著在微球上,溶液內無關的分子可以通過洗滌微球被清除,最后,再采用一系列方法分析純化抗原或與抗原結合的其他分子。整個過程中值得注意的幾個關鍵影響因素如下:

 

1、樣品處理的質量

免疫沉淀實驗成功的關鍵在于第一步樣品處理。免疫沉淀實驗本質是處于天然構象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應,而樣品處理的質量決定了抗原抗體反應中抗原的質量,如抗原的豐度及抗原的構象狀態(tài)。

樣品處理應根據抗原樣品的來源如組織樣品、細胞或其他形式的樣品,選擇適當的方式進行細胞或組織破碎,使待檢抗原釋放至樣品溶液中。裂解緩沖液的使用應注意添加合適的蛋白酶抑制,避免抗原或抗原-其他分子復合物被降解,另外,應選用去垢劑強度合適的裂解液,既保證有效裂解細胞釋放抗原又不破壞蛋白質之間的相互作用。

 

2、抗體的選擇

在考慮抗體特異性的同時,還需考慮抗體對抗原的親和力,如單克隆抗體只對抗原的單一表位具有良好的特異性,因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分,受到破壞,或受其他因素影響,造成抗體不能識別抗原,無法有效形成免疫沉淀復合物,那么這將直接影響免疫沉淀的結果。而多克隆抗體或混合單克隆抗體可以和抗原的多個表位結合,從而解決親和力的問題。但是,并不是所有抗體都能用于免疫沉淀,應選用經IP實驗驗證后的抗體以確保實驗結果的可靠性。此外,不同類型、同類不同亞型的抗體對蛋白 A或G的親和力不同,應選擇合適的抗體及微球用于免疫沉淀。

 

3、微球的選擇

目前廣泛應用于免疫沉淀的微球以結合了蛋白 A或G的瓊脂糖和磁性微球為主。瓊脂糖材料是無色透明、粒徑達微米級的具有多孔表面的微球,有巨大的表面積,蛋白結合量高,曾一度成為免疫沉淀技術中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用離心的方法達到固液分離,而反復離心產生的物理應力極易破壞蛋白的天然構象及完整性,且由于瓊脂糖本身容易破碎,不易保存,限制了瓊脂糖微球在免疫沉淀中的發(fā)展。相比之下,磁性微球其核心為超順磁性粒子,核心外層包裹一層高分子材料,表面平滑,粒徑可達納米級,比表面積大,單位重量的微球蛋白結合量更大。超順磁性微球可以在外加磁場中表現磁性,實現快速有效分離,大大縮短實驗操作時間。溫和的磁性分離方式避免反復離心對蛋白天然構象及完整性的破壞。超順磁性微球在增大機械強度和穩(wěn)定性的同時,縮減了產品造價。上述的優(yōu)勢使超順磁性微球成為免疫沉淀試劑盒行業(yè)的新秀,逐漸被研究者所采用。


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